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                        斑馬魚基因敲除技術服務平臺

                        有關技術服務咨詢,請聯系 潘魯湲 博士 (luyuanpan@ihb.ac.cn)

                        平臺服務描述

                             基因敲除技術是人為地使靶基因的序列發生堿基對的增添、缺失或替換,引起的靶基因結構的改變,以達到定點修飾改造特定基因的目的。基因敲除技術是反向遺傳學研究中最重要的技術工具。基因敲除斑馬魚廣泛應用于遺傳學、發育生物學、細胞生物學、醫學、環境毒理學、水產育種學等研究領域。

                             中心是我國唯一的國家級斑馬魚資源平臺,擁有規模最大和規格最高的單體斑馬魚養殖系統和一支高素質的專業人才隊伍,保證以最高標準、最高質量和最高效率完成相關技術服務。 


                        中心養殖系統


                             目前,中心提供
                        TALEN和CRISPR/cas9技術介導的斑馬魚基因敲除技術服務。如您對條件性基因敲除(conditional knockout)或者基因精細修飾感興趣,也歡迎您與我們進行詳細溝通。

                          

                        1TALENtranscription activator-like (TAL) effector nucleases)介導的敲除服務

                             植物細菌Xanthomonas sp.的TAL蛋白的核酸結合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應關系。利用TAL的序列模塊,可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白,從而達到靶向操作內源性基因的目的。該技術首先需要構建針對任意特定核酸靶序列的重組核酸酶,在特異的位點打斷目標基因DNA,進而在該位點進行DNA操作,如Knock-out、Knock-in或點突變。

                             中心構建了斑馬魚原始生殖細胞(PGC)高效、特異表達的TALEN平臺,相比常規的TALEN敲除平臺,可更加高效地篩選獲得TALEN敲除子代(特別是針對于效率較低的TALEN靶位而言)。

                         

                        TALEN技術原理示意圖

                         

                        2、CRISPR/Cas9介導的敲除服務

                             規律成簇間隔短回文重復(CRISPR)是一類廣泛分布于細菌基因組中的重復結構,經轉錄并加工成短的crRNA(CRISPR RNA)。crRNA通過堿基配對與tracrRNA(trans-activating RNA)結合,形成雙鏈RNA,引導內切酶Cas蛋白(CRISPR-associated protein)在crRNA序列靶標的特定位點剪切雙鏈DNA。根據CRISPR-Cas系統的作用原理,可利用其進行真核生物基因組改造,即在靶標DNA上實現特定位點的剪切,在剪切后的修復過程中會引入靶向DNA序列的突變。該技術中使用的gRNA(guide-RNA)是將crRNA和tracrRNA連接起來作為引導RNA,Cas9蛋白是type II CRISPR-Cas系統中的成員之一,具有HNH和RuvC-like兩個核酸酶結構域,分別剪切靶標DNA的互補鏈和非互補鏈。

                             中心構建了斑馬魚原始生殖細胞(PGC)高效、特異表達斑馬魚偏好密碼子Cas9(zCas9)的CRISPR/Cas9敲除平臺,相比常規的Cas9敲除平臺,可更加高效地篩選獲得Cas9敲除子代(特別是針對于效率較低的Cas9靶位而言);同時,中心也提供雙缺口(double nicking)的Cas9基因敲除服務,可以大大降低Cas9敲除的脫靶效應。

                         

                        gRNA-Cas9技術原理示意圖

                         

                         

                        特異、高效的斑馬魚PGC操作平臺

                         

                         

                        平臺服務內容和流程

                             目前我們提供AB背景的基因敲除斑馬魚制備,AB是最為普遍使用的標準純遺傳背景之一,直接保證了委托方得到純凈背景的基因敲除斑馬魚。同時根據委托方的需求,我們也提供TU以及其它遺傳背景的基因敲除制備。

                        1. 歡迎和我們就技術細節和具體需求進行討論,雙方簽訂技術服務合同。

                        2. 平臺完成由雙方商議確定的技術進行載體構建。包括制備TALEN序列識別模塊(1周)或者合成gRNA(2-3天)。

                        3. 胚胎顯微注射及突變檢測。平臺向斑馬魚胚胎中注射TALEN mRNA或者gRNA-cas9 mRNA復合物。鑒定注射的胚胎群體是否產生靶向突變,如有,將P0代突變斑馬魚培養至性成熟(3月)。

                        4. 篩選出能傳遞目的基因敲除的P0代斑馬魚,與野生型斑馬魚雜交(或同一基因型P0代自交),建立F1代(5天)。

                        5. 將F1代突變斑馬魚培養至2月齡(能夠剪尾鰭進行逐尾鑒定),鑒定目的基因成功敲除的F1代并刻畫敲除的基因型,交付委托方(2個月)。

                         

                        服務承諾

                           中心承諾在簽訂協議后140個工作日內,針對每個靶基因提供至少成功研制敲除品系  ≥2  尾PCR鑒定陽性的F1代斑馬魚(每個移碼框突變陽性斑馬魚≥1 尾)和相應的側交F2代胚胎(≥100枚)。

                         


                        典型突變測序峰圖

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