腸道、肝胰臟及腎臟特異性標記轉基因斑馬魚

       脊椎動物的器官形成是一個錯綜復雜的發育過程。斑馬魚胚胎通體透明的優勢，加上轉基因模型所提供的組織特異熒光蛋白表達使得研究者能夠對研究目標進行標記和實時觀察，這就像黑暗中的燈光照亮了魚類內臟團中器官發育、免疫應答、疾病防治中難以觀察到的細節。因此，帶有熒光報告系統的腸道、胰臟、肝臟、腎臟等轉基因斑馬魚對于這些研究的快速發展具有重要作用。

       斑馬魚胰臟和肝臟都起源于早期胚胎發育中的內胚層細胞。位于背側的內胚層細胞分化成胰腺組織，而位于腹側的內胚層分化成肝芽[1]。發育成胰腺組織的內胚層結構分別被稱為背芽（DB）和腹芽（VB）。其中，DB于24hpf在腸道的背部面上完成形態建成，早期形成的胰內細胞在那里聚集形成初級胰島；34hpf后位于胰島前端的一群腸道細胞形成VB，隨后VB細胞逐漸形成胰外分泌腺、胰管和部分胰內細胞（圖1）[2]。斑馬魚早期肝臟形成可分為芽生期和生長期，24~28hpf，遷移至斑馬魚咽部后方的內胚層細胞聚集變厚，逐漸形成肝芽雛形，在隨后的6~10小時內，肝管將肝臟和食道、腸道等其它消化器官鏈接起來完成肝芽發生；50~96hpf，肝芽和成肝細胞進一步增值、分化形成肝細胞、膽管細胞以及左右肝葉（圖1 ）[3]。斑馬魚腸管也起源于內胚層，形成始于體節中期至后期（18體節），26~126hpf，斑馬魚腸道的管腔形成并不斷的生長，內胚層分化出連續的有功能的腸道上皮，從形態上可以分為3 段(腸球、中腸和后腸)[4, 5]。

 

       而斑馬魚的腎臟起源于中胚層，其發育經歷前腎和中腎兩個階段，其腎元和哺乳動物的后腎在結構和功能上非常相似。前腎起源于魚體兩側條狀胚層的腎祖細胞，80dpf后發育成熟，是斑馬魚胚胎和幼魚階段的功能性泌尿器官。中腎在12-14dpf開始形成，前腎隨之在30~60dpf退化。中腎發育成熟后，后續生命過程中還會不斷有新的腎元產生，以適應體重增加和損傷后修復需要（ 圖2 ）[7]。

       國家斑馬魚資源中心多年來收集并保存了多個肝臟、胰臟、腎臟表達熒光蛋白的轉基因品系，已經在中心網站發布，現做一歸納匯總，方便廣大科研工作者更好的開展工作，具體清單請見文末，現就常用品系逐一進行介紹。

       首先介紹胰臟特異性標記的熒光品系。CZ15 (rj29Tg, Tg(ins:EGFP))和CZ72 (jh2Tg, Tg(ins:mCherry))。這兩個品系均為斑馬魚胰島素preproinsulin（ins）啟動子序列特異性在胰腺中驅動胰島β細胞持續性表達綠色或者紅色熒光蛋白（ 圖3/4 ）[9, 10]。它們從胚胎胰腺發育初期直至成魚期，都可以特異性標記胰島β細胞，因此被廣泛應用于追蹤胰腺器官發生以及胰島β細胞發生的全部過程。

圖4 CZ72 (jh2Tg,Tg(ins:mCherry))

       接著介紹肝臟特異性標記的熒光品系。CZ320/CZ321(ihb175Tg, Tg(-1.7apoa2:GFP))和(ihb176Tg, Tg(-1.7apoa2:RFP))這兩個品系其實都是由斑馬魚14kDa阿樸脂蛋白（Apo-14）啟動子序列驅動綠色/紅色熒光蛋白報告基因表達的轉基因斑馬魚（ 圖5/6 ）[11]。由于Apo-14啟動子驅動的綠色/紅色熒光蛋白持續地表達在肝原基和成魚肝臟中的成肝細胞、肝祖細胞和肝細胞中，因此這兩個品系可以詳細觀察記錄肝臟器官發生的動態過程，為研究肝臟發育及其器官發生提供了一個從早期內胚層細胞直到完整的肝臟器官形成都可觀察的轉基因工具。

圖5 CZ320 (ihb175Tg, Tg(-1.7apoa2:GFP))

圖6 CZ321 (ihb176Tg, Tg(-1.7apoa2:RFP))

       此外，CZRC還保存有肝胰臟雙標記斑馬魚品系。CZ16(gz15Tg, Tg(fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP)) 該品系為一個雙色熒光轉基因斑馬魚。該品系中采用斑馬魚肝臟脂肪酸結合蛋白（fabp10a）啟動子序列驅動紅色熒光蛋白在肝臟中表達，同時串聯有胰腺彈性蛋白酶3（ ela3l）啟動子驅動綠色熒光蛋白在胰腺中表達（ 圖7 ）[12]。因此它是一個重要的，可以同時研究肝膽胰腺多器官發生和器官邊界的類器官模型。例如，曾有研究通過正向篩查該品系背景下的DNA甲基轉移酶（dnmt1）基因突變體中的胰腺和肝臟器官形態變化，確認了在dnmt1突變體中胰腺和肝臟能正常形成，但在84hpf后胰腺和肝臟開始退化；說明了dnmt1基因對于胰管及其它內分泌細胞的形成是必需的，但對于腺泡細胞的生存卻不是必需的[13]。

 
圖7 CZ16 (gz15Tg, Tg(fabp10a:dsRed;ela3l:EGFP))

圖8 CZ336  (ip1Tg, Tg(ifnphi1:mCherry))

       最后介紹腎臟特異性標記的熒光品系。CZ104 (ihb50Tg，Tg(Eco.Tshb:EGFP))該品系為石斑魚促甲狀腺激素thyroid-stimulating hormoneβ-subunit (tshβ) 啟動子序列驅動綠色熒光蛋白報告基因(EGFP)在腎小管特異性表達（ 圖9 ）[16]。于斑馬魚的內源性tshβ類似，gtshβ(石斑魚tshβ)序列也可以驅動GFP在垂體和腎臟中表達，近端腎小管的發育細節在該轉基因斑馬魚品系中得到了標記。因此，該品系成為了研究腎小管發育以及了解石斑魚tshβ基因功能及其分布的重要工具。

圖9 CZ104 (ihb50Tg, Tg(Eco.Tshb:EGFP) )[16]

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