心血管特異標記的轉基因斑馬魚品系推薦

作者：zhangyun 發布時間：2020/6/22 4:00:00

斑馬魚體型小，易于養殖，體外受精和發育，且早期胚胎透明，易于觀察及操作，受精后24小時主要的組織器官原基已形成，是理想的實驗動物。斑馬魚胚胎可以靠被動擴散供氧生存相當長時間，因而具有嚴重心血管發育缺陷的胚胎也能夠在早期發育中存活。這些優點使斑馬魚成為研究脊椎動物心血管發育和疾病的強大模型。熒光蛋白標記心血管系統的轉基因斑馬魚品系也在心血管發育、疾病發生、損傷再生、腫瘤發生、癌細胞遷移等諸多研究中成為不可或缺的工具。

在脊椎動物中，心血管系統是胚胎發育中最早形成并行使功能的組織器官之一。 斑馬魚心臟發育大概分為以下幾個階段：最早于5hpf，中胚層前外側板出現心臟的前體細胞；15hpf 左右心臟前體細胞向胚胎中線處融合并成心錐，然后向前延伸形成線性的心管；約22hpf心臟開始出現收縮；28hpf左右心房和心室形成；48hpf左右瓣膜形成，新房心室可清晰識別[1]。和高等脊椎動物一樣，斑馬魚的血管原細胞也來源于中胚層，14-16hpf遷移至軀干中線部位并形成血管索。然后，血管原細胞分化形成成血管細胞和造血細胞。成血管細胞進一步分化形成軸向血管、背部主動脈和后主靜脈，約24hpf 開始出現血液循環[2]。

圖1 斑馬魚胚胎的心臟血管系統

國家斑馬魚資源中心多年來收集并保藏了多個心臟血管表達熒光蛋白的轉基因品系，都已在中心網站發布，現做一歸納匯總，方便廣大科研工作者更好的開展工作。全部心血管標記的清單見文末，現就常用品系逐一進行介紹。

首先介紹心臟特異性標記的熒光品系。CZ56(f1Tg,Tg(myl7:eGFP))該品系為心肌細胞特異性表達基因myosin light chain 7(myl7)啟動子調控綠色熒光蛋白(eGFP)在整個心臟肌肉細胞內表達（圖2）[3]。被廣泛應用于各種心血管模型以及心臟疾病的研究。

圖2 CZ56 (f1Tg, Tg(myl7:eGFP) )

CZ1249 (f2Tg, Tg(-5.1myl7:DsRed2-NLS) )該品系為myl7啟動子驅動紅色熒光蛋白(DsRed2)在整個心臟肌肉細胞核內表達（圖3）[4]。相比于CZ56，該品系表達熒光蛋白顏色不同且帶有核定位信號。

圖3 CZ1249(f2Tg, Tg(-5.1myl7:DsRed2-NLS))

CZ1251 ：TgBAC(-36nkx2.5:ZsYellow) 該品系為心臟前體細胞特化的關鍵轉錄因子nkx2.5啟動子調控黃色熒光蛋白在心管內表達（圖4）[5]。 nkx2.5基因為脊椎動物心肌發育中最早表達的轉錄因子，也是心臟祖細胞的進化保守標記基因，與房間隔缺損、室間隔缺損、法絡氏四聯征、主動脈狹窄等心臟發育缺損相關，在心臟發育中發揮重要作用[6-9]。該品系對研究心肌細胞分化；心血管細胞的形成及分化具有重要作用。

圖4 CZ1251 (TgBAC(-36nkx2.5:ZsYellow))

除了以上心臟特異表達的轉基因品系，CZRC還保藏了很多血管特異表達的轉基因品系，如經典的kinase insert domainreceptor like（kdrl，原名flk1）啟動子調控多種熒光蛋白在血管特異表達的轉基因品系：CZ62 (s843Tg, Tg(kdrl:EGFP)，圖5)， CZ63 (is5Tg, Tg(kdrl:mCherry)，圖6) 和CZ70 (la4Tg, Tg(kdrl:RFP))。Kdrl具有蛋白酪氨酸激酶活性，參與循環系統發育和甲狀腺發育[10]。kdrl啟動子調控的熒光蛋白除在心血管系統之外，在頭部、中胚層和腹膜區等細胞中表達[11]。

圖5 CZ62 (s843Tg, Tg(kdrl:EGFP))

圖6 CZ63 (is5Tg, Tg(kdrl:mCherry))

另一常用的心血管系統標記為Fli-1 proto-oncogene, ETS transcription factor a (fli1）啟動子調控的轉基因品系CZ55 (y1Tg, Tg(fli1:EGFP)，圖7)和CZ76 (um13Tg, Tg(fli1.ep:DsRedEx)，圖8)，也是常用的血管內皮特異性表達熒光蛋白的轉基因品。相較于kdrl，fli1的表達更廣泛，除了血管內皮，還同時標記淋巴管及冠狀動脈 [12-14]，同時fli1也可標記生血內皮[15]。

圖7 CZ55(y1Tg, Tg(fli1a:EGFP))

圖8 CZ76 (um13Tg, Tg(fli1a.ep:DsRedEx))

除這些常用品系外，CZRC還保藏有另外一些心血管相關標記的品系，有興趣的研究者可以訪問下表提供的鏈接進行查詢。有問題歡迎隨時致電或發郵件到CZRC工作郵箱查詢。

CZ ID	Genotype	Construct
CZ40	ihb6Tg/+	Tg(zp3:fsta,myl7:EGFP)
CZ55	y1Tg/+	Tg(fli1a:EGFP)
CZ56	f1Tg/+	Tg(myl7:GFP)
CZ62	s843Tg/+	Tg(kdrl:EGFP)
CZ63	is5Tg/+	Tg(kdrl:mCherry)
CZ70	la4Tg/+	Tg(kdrl:RFP)
CZ76	um13Tg/+	Tg(fli1a.ep:DsRedEx)
CZ152	Tg(hsp:vegf165);Tg(kdrl:GFP)	Tg(hsp:vegf165);Tg(kdrl:GFP)
CZ286	gd14Tg/+	Tg(zp3b:zar1,myl7:EGFP)

CZ1249	f2Tg/+	Tg(-5.1myl7:DsRed2-NLS)
CZ1251	fb7Tg/+	TgBAC(-36nkx2.5:ZsYellow)

參考文獻：
1. Bakkers, J., Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res, 2011. 91(2): 279-88.
2. Hogan BM, Schulte-Merker S. How to Plumb a Pisces: Understanding Vascular Development and Disease Using Zebrafish Embryos. Dev Cell. 2017;42(6):567-583.
3. Burns CG, Milan DJ, Grande EJ, et al.. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nat Chem Biol. 2005;1(5):263-264.
4. Mably JD, Mohideen MA, Burns CG, et al. heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish. Curr Biol. 2003;13(24):2138-2147.
5. Zhou Y, Cashman TJ, Nevis KR, et al. Latent TGF-β binding protein 3 identifies a second heart field in zebrafish. Nature. 2011 May 29;474(7353):645-8.
6. Kim EY, Chen L, Ma Y,et al. Expression of sumoylation deficient Nkx2.5 mutant in Nkx2.5 haploinsufficient mice leads to congenital heart defects. PLoS One. 2011;6(6):e20803.
7. Espinoza-Lewis RA, Liu H, Sun C, et al. Ectopic expression of Nkx2.5 suppresses the formation of the sinoatrial node in mice. Dev Biol. 2011;356(2):359-369.
8. Wang J, Lu Y, Chen H, et al. Investigation of somatic NKX2-5, GATA4 and HAND1 mutations in patients with tetralogy of Fallot. Pathology. 2011;43(4):322-326.
9. Terada R, Warren S, Lu JT,et al. Ablation of Nkx2-5 at mid-embryonic stage results in premature lethality and cardiac malformation. Cardiovasc Res. 2011;91(2):289-299.
10. Liao W, Bisgrove BW, Sawyer H, et al. The zebrafish gene cloche acts upstream of a flk-1 homologue to regulate endothelial cell differentiation. Development. 1997;124(2):381-389.
11. Jin SW, Beis D, Mitchell T, Chen JN, Stainier DY. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 2005;132(23):5199-5209.
12. Harrison MR, Bussmann J, Huang Y, et al. Chemokine-guided angiogenesis directs coronary vasculature formation in zebrafish. Dev Cell. 2015;33(4):442-454.
13. Yaniv K, Isogai S, Castranova D, Dye L, Hitomi J, Weinstein BM. Live imaging of lymphatic development in the zebrafish. Nat Med. 2006;12(6):711-716.
14. Lawson ND, Weinstein BM. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 2002;248(2):307-318.
15. Butko E, Distel M, Pouget C, et al. Gata2b is a restricted early regulator of hemogenic endothelium in the zebrafish embryo. Development. 2015;142(6):1050-1061.

QQ空間新浪微博騰訊微博人人網更多